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アプリケーション
Author: Niklas Biere, Miriam Boehmler
Last updated: 12 May 2026
マイクロプラスチック分析が確立された研究分野となっている一方で、通常1000 nm未満のポリマー粒子であるナノプラスチックの特性評価は、依然として分析における大きな課題となっています。ラマン分光法に基づく粒子分析を含む多くの確立された手法は、原理的に光学回折限界による制約を受けます。粒子の寸法がこの限界に近づくか、それを下回ると、従来のラマン顕微鏡を用いてそれらを検出し、確実に同定し、サイズを評価することはますます困難になります。
本アプリケーションノートでは、自動化された相関顕微鏡法がこうした限界をどのように克服し、200 nmの微小な粒子まで特性評価できるかを実証します。ParticleScoutを用いたラマン分光法の化学的特異性と、原子間力顕微鏡（AFM）が持つナノメートルスケールの寸法精度を組み合わせることで、自動粒子分析の実用的な限界に挑みます。この統合されたワークフローは、いずれの単独手法でも到達できないレベルの完全性と信頼性をもたらします。
結果として得られるこの相関手法は、光学的特性評価とナノスケールの特性評価との間のギャップを埋め、より高い堅牢性と分析の信頼性をもって、ナノプラスチックの正確な検出、サイズ測定、および同定を可能にします。
生物学的または環境的な課題に関連するマイクロプラスチックやナノプラスチックの汚染物質は、食品の包装材や加工装置に由来することがよくあります。マトリックス（母材）のシンプルさを保ちながらこのような汚染を再現するには、飲料水が理想的な試験系となります。簡単にろ過でき、分析の妨げとなる粒子のバックグラウンドを発生させないためです。
相関ワークフローの限界を評価するため、模擬モデルサンプルを作製しました。ミネラルウォーターに既知の組成とサイズのポリマービーズを添加（スパイク）し、100 mLの懸濁液をろ過しました。測定は、ろ過基板上で直接実施されました。
粒子からの信号は非常に微弱であるため、フィルター自体がラマンバックグラウンドを発しないこと、そしてフィルターの表面構造と粒子を区別できる程度に十分に平坦であることが求められます。
このため、酸化アルミニウム（アルミナ）メンブレンフィルター（Al₂O₃、0.2 µm、47 mm）やシリコンフィルターは、この種の調査において非常に適した基板となります。酸化アルミニウムフィルターは十分に平坦であり、数個のバンドのみからなる中程度のラマンバックグラウンドしか生じさせません。一方、適していない例としては、ポリカーボネートフィルター（指紋領域に強いラマンバンドを持つため）やセルロースフィルター（表面の粗さが大きいため）などが挙げられます。
直感に反するかもしれませんが、特定の条件下では、分解能限界以下の粒子であっても検出可能なラマンスペクトルを生成し、さらにはカメラ画像上で視認できることさえあります。回折限界の制約下で画像取得を行った結果として、粒子はぼやけて見えます。より正確に言えば、点像分布関数（PSF）との畳み込みとして現れます。したがって、特にレーザー出力と積算時間を制御できる場合には、検出体積よりも小さな粒子からでもラマンスペクトルを取得することが可能です。witec360ラマン顕微鏡の高い共焦点性により、バックグラウンドの寄与が最小限に抑えられ、ナノスケール粒子からの微弱な信号の検出が可能になります。
使用した装置は、励起波長532 nmのwitec360相関ラマン・AFM顕微鏡です。粒子分析において特に重要となるのが、暗視野モード顕微鏡およびParticleScoutの拡張機能です。ラマン分光法だけでなく、光学的な粒子画像の取得にも、高倍率の明視野/暗視野対物レンズ（例：100倍）が使用されます。ParticleScoutは、光学的コントラストに基づいて粒子を識別します。暗視野照明を使用することで、特に酸化アルミニウムやシリコンなどの平坦な基板上において、視認性が大幅に向上します。
ParticleScoutは、識別された各粒子に対して1つのラマンスペクトルを自動的に取得します。どの粒子を測定するかは、例えばサイズや形状によって事前にフィルタリングすることが可能です。本研究では、面積が5 µm²未満の粒子のみを分析対象としています。
スペクトルの取得は、励起波長532 nm、出力5.0 mWの条件下で、倍率100倍、開口数（NA）0.9の対物レンズを使用して実施されました。スペクトルは、積算時間3秒、積算回数7回で取得されました。焦点位置は一定に保たれ、測定前に1つの粒子上で最適化されました。
図１:ParticleScoutのインターフェース。測定対象の粒子は、フィルター機能を使用するか、左側の粒子一覧リストから手動で選択できます。右上部には、選択した粒子の詳細が表示されます。サンプルの暗視野画像は右下部に表示されます。
TrueMatchおよびエスティジャパンのスペクトルデータベースを用いたデータベース同定後、ポリマーとして正常に同定された粒子のみをその後のAFM分析に使用するよう、粒子をフィルタリングすることができます。今回の概念実証では、15個の粒子がポリマー材料であると特定され、さらに詳細な調査が行われました。最適なヒット率を得るためには、対物レンズを適切に校正および補正する必要があり、オートフォーカスを利用することも可能です。
図2：ParticleScoutのレポート機能。同定された材料および粒子間におけるその分布に関して自動生成された図表。
ParticleScoutは、中心座標を含む、検出された各粒子の幾何学的データを提供します。witec360システムは完全に統合されているため、コンポーネントを交換したりサンプルを移動したりすることなく、測定モードをシームレスに切り替えることができます。これにより、これらの座標をSample RasterのPoint List Editorに転送し、シンプルなワークフローで各粒子の位置においてAFMプロセススクリプトを自動実行することが可能になります。
図3：Sample Raster機能のPoint List Editor（左）および、個々のAFM画像の位置を示す光学的全体スティッチング画像（右）。
ユーザーへのヒント：このAFM用プロセススクリプトは、自動的に探針（チップ）を接近させ、画像スキャンを実行し（AFMモードであることを前提とします）、探針を後退させます（垂直方向の距離は定義可能であり、ここでは20 µmに設定）。以下の位置コマンドにより、アプローチが確実に画像の中心で行われるようになります：storeposition; tipapproach; imagescan; movezmicroscope; gotoposition
全体の測定時間を短く抑える上で、少ないピクセル数でも十分です。ここでは、15×15 µm²の画像サイズに対して150×100ピクセルを選択しています。ラインタイムを1秒/ラインに設定すると、1画像あたり約5分となります。この例にある15個の粒子の場合、移動時間とアプローチ時間を含めたAFM測定の合計時間は1時間18分となり、その間ユーザーの操作は一切必要ありません。
図4：自動AFM測定から得られた代表的なトポグラフィー画像および高さプロファイル。粒子の一部は個別の粒子であることが確認されましたが、他は小さな凝集体でした。図に見られるように、粒子は常に画像の中心に位置しています。これはシステムの安定性を示すものであり、さらに小さな画像サイズやより高速な測定も可能となります。
データ分析
バックグラウンドであるメンブレン（フィルター）のトポグラフィーを補正するため、各AFM画像は多項式平面減算（5次）を用いて処理されました。粒子のモルフォロジー（形態）がシンプルであるため、マスキングは不要でした。
ナノスケールの粒子において、高さプロファイルは最も信頼性の高いサイズ指標となります。横方向の寸法は探針（チップ）のコンボリューション（形状の畳み込み）や粒子のクラスタリングによる影響を受けますが、高さの測定値は堅牢（ロバスト）です。したがって、粒子の高さには断面プロファイルの最大値が採用されました。
結果
AFMによる高さの測定値と、ラマン分光法に基づく材料同定結果を統合し、相関データセットを作成しました。ここで測定された例では、ポリスチレン（PS）ビーズは2つのサイズの集団（約275 nmと約500 nm）として確認されました。一方、ポリメタクリル酸メチル（PMMA）は、より小さな集団（約275 nm）のみに確認されました。
図5：AFMから得られた粒子の高さと、ParticleScoutによる化学的同定結果を相関させたヒストグラム。
粒子数は限られているものの、ラマン分光法とAFMを組み合わせたアプローチは、相関分析の強みを明確に示しています。
これらを組み合わせることで、いずれかの手法単独では到達できないナノスケール粒子の確実な特性評価が可能になります。
まとめ
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